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Lysozyme with Low Concentration |
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Introduction
Lysozyme 은 muramidase 또는 N-acetylmuramide glycanhydrolase 로도 알려져 있으며, 눈물, 타액, 모유, 점액 등 다양한 분비물에서 풍부하게 존재합니다.
이는 동물에 의해 생성되는 항균 효소로, 선천적인 면역 시스템의 일부분을 이루며 세균 감염을 예방하는 데 중요한 역할을 합니다.
Lysozyme 은 특정 박테리아의 세포벽을 파괴하여 약한 방부제 역할을 합니다.
Lysozyme 은 그람 양성 박테리아를 용해시키는 데 흔히 사용되는 효소입니다. 예를 들어, E. coli 는 periplasmic 공간의 내용을 방출하기 위해
lysozyme 을 사용해 용해시킬 수 있습니다. Lysozyme 은 X-ray 회절을 통해 구조가 처음으로 밝혀진 효소입니다.
Lysozyme 의 1차 구조는 129 개의 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩타이드입니다. 생리학적 조건에서 lysozyme은 단백질 표면에 긴 틈새를 가진
콤팩트하고 구형의 구조로 접혀 있습니다. 비교적 간단한 구조와 저렴한 비용 덕분에 현재 생물학 연구에서 인기 있는 모델로 사용됩니다.
Lysozyme 의 분자량은 14.4 kDa 로 작으며, 높은 온도에서 변성됩니다. Lysozyme 의 산란 강도는 매우 약해서 DLS (동적 광 산란) 측정이 매우 어려운 시료입니다.
Experiment
이번 연구에서는 BeNano 90 Zeta Nano Particle Size & Zeta Potential 분석장비를 사용하여 Lysozye 샘플을 분석하였습니다.
BeNano 90 Zeta 에서는 신호 대 잡음비 (Signal-to-Noise Ratio) 를 최대화하기 위해 단일 모드 광섬유를 신호 전송에 사용하며,
극미세 입자의 빠른 상관 함수 감쇠를 충분히 계산할 수 있도록 고속 상관기 (High-Speed Correlators) 를 활용하였습니다.
Lysozyme 샘플은 pH 7의 PBS 완충 용액에서 다양한 농도로 준비되었습니다. 샘플 정보는 다음과 같습니다
Table 1-4. Information on lysozyme sample
측정 온도는 25 ± 0.1℃ 로 설정되었습니다. Lysozyme 분자가 매우 작고 산란 강도가 매우 약했기 때문에 먼지와 같은 불순물이 측정 결과에 큰 영향을 미칠 수 있었습니다.
따라서 측정 전에 샘플은 220 nm 필터로 필터링되었습니다. 각 샘플은 결과의 반복성을 조사하기 위해 최소 세 번 측정되었습니다.
Results and Discussion
산란된 빛 신호를 통해 샘플의 상관 함수가 얻어졌다.
그림 1-16 부터 그림 1-19 에서 보여주듯이, 작은 입자의 상관 함수는 빠른 브라운 운동으로 인해 매우 빠르게 감소하였다.
상관 함수의 신호 대 잡음 비율은 충분히 높아서 우수한 반복성을 보여주었다.
Figure 1-16. Correlation functions of 10 mg/mL lysozyme.
Figure 1-17. Size distributions of 10 mg/mL lysozyme
Figure 1-18. Correlation functions of 5 mg/mL lysozyme
Figure 1-19. Size distributions of 5 mg/mL lysozyme.
Table 1-5 에서 보여주듯이, Lysozyme 의 입자 크기는 3 에서 4 nm 사이로 측정되었다. Lysozyme 의 분자량은 K 와 α 상수를 사용하는 Mark-Houwink 방정식을 통해 계산할 수 있다.
30 mg/mL 의 농도에서 계산된 Lysozyme 의 분자량 (12.6 KDa) 은 Lysozyme 의 이론적 값 (14.4 KDa) 과 매우 근접함을 알 수 있다
Table 1-5. Particle sizes of lysozyme at different concentrations at 25℃
Figure 1-20 부터 Figure 1-23 에서 볼 수 있듯이, Lysozyme 의 입자 크기는 처음에 작고 상온(25℃)에서 좁은 분포를 보였으나, 고온에서는 단백질 변성으로 인해 큰 Lysozyme 응집체가 형성되었다.
Figure 1-20. Size distribution of 30 mg/mL lysozyme at 25℃
Figure 1-21. Size distribution of 30 mg/mL lysozyme at 45℃.
Figure 1-22. Size distribution of 30 mg/mL lysozyme at 56℃.
Figure 1-23. Size distributions of 30 mg/mL lysozyme at different temperatures
Lysozyme 의 Z-평균과 산란 강도는 50℃ 이하의 다양한 온도에서 안정적이었으나, 55℃를 초과하면 고온에서 Lysozyme 의 변성으로 인한 구조적 변화와 그에 따른
다량의 응집체 생성으로 인해 급격히 증가하였다.
Conclusion
이 Application Note 에서는 BeNano 90 Zeta 를 사용하여 30mg/mL 농도의 Lysozyme 입자 크기를 측정한 결과, 3.63nm ± 0.22nm로 나타났으며
또한 Lysozyme 의 분자량은 경험적인 Mark-Houwink 방정식을 통해 12.6 KDa 로 계산되었다.
BeNano 90 Zeta 의 정밀한 온도 제어 시스템에 의해 고온에서의 Lysozyme 의 Denaturation 연구를 성공적으로 수행했습니다.
Figure 1-24. Z-average sizes of 30 mg/mL lysozyme at different temperatures.
Figure 1-25. Scattering intensities of 30 mg/mL lysozyme at different temperatures.
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