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INTRODUCTION
Liposome 은 하나 또는 그 이상의 bi-layered membrane 으로 구성된 spherical lipid vesicle 이다. 이러한 liposome 의 제조에 가장 많이 사용되는 것은 Phospholipids 이다.
왜냐하면 Lipid bi-layers 로 둘러싸인 aqueous cores 구조적 특성상 liposome 은 핵산을 포함한 hydrophilic actives 를 캡슐화하고 전달할 수 있기 때문이다.
그래서 다른 lipid-based delivery systems 와 비교 시 가장 우수하다
이러한 Liposome 을 소량으로 제조하는 방법은 많지만 생산 규모로 제조하는 방법은 손에 꼽을 만큼 적다. 왜냐하면 lipids, 시간, 예산, 필요한 lipids 의 품질, 캡슐화 할 active ingredients 등
많은 요소를 고려하여 제조해야하기 때문이다.
CHOICE OF PREPARATION TECHNOLOGIES
Liposome 제작법은 다음 두 가지가 있다.
(1) lipid hydration 방법에 기반한 top-down 법
(2) solvent 와 non-solvent streams 을 혼합한 후 precipitation 을 사용하여 원하는 크기와 lamellarity 를 가진 liposome을 제조하는 bottom-up 법
Lipid hydration method (Top-down)
전통적인 top-down 방법이라 하면 (1) thin film 또는 (2) lipid 와 lipophilic active ingredients 의 혼합물을 제조한 후 이 결과물을 수용액에 수화한다.
그러나 Phospholipids 은 수화 상태에서 다시 bi-layered 구조로 조립되면서 불균질한 large unilamellar vesicles (LUVs) 및 multilayered vesicles (MLVs) 를 형성하기 때문에
원하는 크기와 lamellarity 를 얻기 위해서는 다양한 기계적 기술을 통해 크기를 줄이고 conditioning 작업이 필요하다.
Solvent injection method (Bottom-up)
Top-down 방법과 반대로 bottom-up 방법은 침전을 이용하여 liposome vesicles 를 직접 생성한다.
Liposome 을 형성하는 성분은 유기용매에 용해되는데 이때 사용되는 유기용매는 water miscible 특성을 띤다.
이 용해액을 수용액 버퍼 시스템 (aqueous buffer system) 에 천천히 주입한다. 주입할 때 small unilamellar vesicles (SUV) 와 LUV 가 형성된다.
이는 주입을 통해 유기용매가 수용액으로 변경되면서 용해도가 변하기 때문이다.
ALTERNATIVE APPROACHES USING MICROFLUIDIZER TECHNOLOGY
Microfluidizer processor 를 사용하면 위에서 나열한 lipid film을 만드는 과정을 거치지 않고도 liposomes 을 생산할 수 있다. 아래에서 이에 관련한 내용을 소개하고자 한다.
Lipid solution method
| 1. |
모든 lipid, lipophilic ingredients 는 에탄올과 같은 water miscible solvent 에 용해 후 aqueous phase 에 추가한다.
이 결과물은 low shear mixer 로 전처리 한 후 Microfludizer processor 로 처리한다.
이는 위에서 소개한 solvent injection method (bottom-up) 방법과 유사하나 다른 점이 있다.
전처리 과정에서 이미 MLV 이 생성되고 Microfluldizer 를 통한 후처리 과정에서 SUV 가 생성되기 때문에 vesicle formation mechanism 이 다르다는 것이다.
따라서 후처리 후 solvent 가 제거되어야 한다. |
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| 2. |
Double emulsion method 를 이용한 hydrophilic active encapsulation 을 할 수 있다. Hydrophilic drugs 를 포함하고 있는
Aqueous phase (W1) 을 lipid solution (O) 와 섞어서 water-in-oil (W1/O) 에멀젼을 만든다.
(이때 O 는 water immiscible solvent 에 모든 lipid ingredients 가 용해되어 있는 상태이다. )
W1/O 에멀젼은 다시 second aqueous (W2) 와 섞어서 W1/O/W2 에멀젼을 만든다.
그 후 Microfluidizer processor 로 처리하고 solvent 를 제거하면 final solution 이 포함된 liposome vesicles 을 얻을 수 있다.
이 방법은 encapsulation efficiency 가 매우 높다. 최근 문헌*에 따르면 plasmid DNA (inside two different cationic liposome formulations) 의 경우
80% 의 encapsulation 성공을 보고했다.
* Lajunen, T., et al.
'Topical drug delivery to retinal pigment epithelium with microfluidizer produced small liposomes.' European Journal of Pharmaceutical Sciences 62 (2014): 23-32. |
Solvent free method
지금부터 소개할 solvent free method 는 몇몇 lipsome formulation 에 적용되는 신기술이다. Lipid films 이나 solution 을 통한
liposome forming 이 아니기 때문에 유기용매가 없는 결과물을 만들 수 있다.
Microfluidizer 로 처리하여 다운사이징된 lipophilic actives (with aqueous buffer solutions) 와 dry lipid ingrdients 를 바로 혼합하여 liposomes 을 만든다.
해당 방법은 이미 상업화된 리포좀 약물 제품을 모방하는 제형을 생성할 때 적합하다. 또한 임상적으로 적절한 범위 내에서 vesicle size 를 만들 수 있다.
WHY MICROFLUIDICS?
High quality liposomes - Fixed Interaction Chamber™ 및 Microfluidizer processor 의 균일한 압력을 유지하는 펌프 시스템에 의해 안정적이고
균일한 shear 가 생성되고 따라서 균일한 크기의 SUV 제작이 가능하다. Microfluidizer 기술은 liposome 크기를 40 - 50 nm 정도의 작은 사이즈로 줄일 수 있다.
High Concentration - Microfluidics 는 제품을 농축하기 위한 추가적인 downstream process 과정이 필요 없이 therapeutic level 에 부합되는 고농도의 liposome solution 의 생산이 가능하다.
Lipid 농도 범위는 5mM 에서 25mM 이다. Microfluidizer 기술은 readyto-be-administered liposome 약물의 lipid 농도 범주 또는 그 이상의 농도를 가진 liposome 을 생산할 수 있으며,
이는 일반적으로 solvent injection 방법에서 달성할 수 있는 것보다 최대 2배 이상 높다.
Very fast size reduction - 특히 extrusion 또는 microfluidic chip 기술과 같은 slow process 와 비교하면 liposome vesicle 의 크기를 줄이는 처리시간이 훨씬 짧다.
실험실 규모의 Microfluidizer processor 로 1~3리터를 생성하는데 약 10분이 소요된다. 생산용 모델은 시간당 수백 리터를 생산한다.
Scalability - Preclinical 에서 임상 또는 생산 규모로 변경할 때 scalability 를 고려해야 한다. 전통적인 top-down 방식과 bottom-up 방식은 scalable 이 어렵다.
Microfluidizer 기술은 본질적으로 최대 수천 리터의 양으로 scalable 가능하기 때문에 모든 규모의 장비에서 therapeutic concentrations 를 생성이 가능하며 이는 수십 년 동안 입증되었다.
Solvent independent - Microfluidizer 로 liposome vesicle 의 크기를 줄이는 공정에
일반적으로 용매가 사용되지 않기 때문에 추가적인 용매 제거 공정이 필요하지 않다.
그러나 formulation 공정에 용매가 필요한 경우 Microfluidizer processor 의 내부 부품들은 대부분의 용매와 호환되므로 오염을 우려할 필요는 없다.
cGMP ready systems - CIP 및 SIP 기능을 갖춘 cGMP 지원 시스템을 제공한다. Microfluidizer processor 는 cGMP 에 가장 적합하게 설계되었으며 CIP/SIP 작업이 가능하다.
Flexibility - 작동 매개변수를 변경하여 동일한 Microfluidizer processor 로 다양한 크기와 formulation 의 liposome 을 만들 수 있을 뿐만 아니라 liposome 의 크기를 예측할 수 있다.
Sterile Filtration - Pall Life Sciences 의 연구는 Microfluidizer processor 를 사용하여 생산된 liposome 이 220nm 필터로 성공적으로 여과될 수 있음을 증명하였다.
* http://www.pall.com/en/biotech/webinars/sterile-filtration-complex-fluid.html
CHOOSING THE RIGHT METHODOLOGY
CASE STUDY 1 - COMPARING TO THE BOTTOM-UP METHOD
아래 두 가지 방식으로 제조한 liposome 을 비교하였다.
(1) Microfluidizer processor
(2) Microfluidic chip 을 이용한 bottom-up 방식
Results
Table 2 에서와 같이 두 방법 모두 매우 균일한 분포 (Pdls 가 0.1에 가까움) 를 가진 작은 크기의 ( <100nm ) liposome 을 제조하였다. 하지만 Fig.1 을 보면 Microfluidizer 처리 결과가 훨씬
더 작은 vesicle 을 제조했고, 전체적인 사이즈 분포도에서도 훨씬 더 작은 결과를 보여준다.
CASE STUDY 2 - COMPARE TO HIGH PRESSURE HOMOGENIZER (HPH)
아래 두 가지 기기를 이용하여 동일한 시료, 동일한 압력, 동일한 pass 수를 처리한 리포좀을 비교하였다.
(1) Microfluidizer processor
(2) 기존의 고압 균질화기기 (HIGH PRESSURE MONOGENIZER, HPH)
Benefits of fixed geometry & constant pressure
Microfluidizer 기술은 fixed geometry high shear zone 과 균일한 압력의 펌프를 사용한다.
Fig. 2 에서 볼 수 있듯이 Microfluidizer processor 는 이와 같은 특유의 조합을 통해 각 처리 공정 과정에서 일정한 압력을 달성할 수 있다.
하지만 HPH는 목표 압력에서 최대 50% 낮은 가변 압력으로 샘플을 처리한다. 처리하고자 하는 샘플 용량이 1ml 에서 수천 리터로 다양할지라도
Microfluidizer 의 일정한 압력을 유지하는 기술에 의해 모든 샘플에 전달되는 압력이 일정하게 유지된다.
동일한 조건의 처리 결과는 Fig 3 과 Table 3과 같다.
Fig 3 이 보여주듯이 Microfluidizer processor 에 의해 생성된 liposome 입자 크기 분포도는 single peak, 즉 아주 균일한 입도 분포를 보여주는 반면 HPH 에 의해 생성된 결과는
넓은 범위에 걸쳐 three peaks, 즉 다양한 크기 입도 분포를 보여준다.
평균 liposome 입자 크기를 나타낸 Table 3의 결과는 Microfluidizer 기술이 liposome 크기를 줄이는 데 훨씬 더 효율적이라는 것을 증명한다. 또한 Microfluidizer 공정은 단 2 pass 에
100nm 미만의 liposome 을 생성할 수 있었다. 반면에 HPH는 3 pass 처리 후에야 183nm 이 되었다. 이는 Microfluidizer processor 에서 1 pass 처리한 결과인 113nm 보다도 훨씬 큰 결과였다.
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